Procedure laboratorio

Indice:

  • Procedure di accesso
  • Procedure di protezione personale
  • Procedure operative microbiologiche standard
  • Procedure di ingresso
  • Procedure di uscita
  • Procedura per l'eliminazione del materiale
  • Procedure di decontaminazione
  • Agitatori magnetici
  • Pulizia e sanificazione degli ambienti
  • Pesatura
  • Misurazione liquidi
  • Pulizia vetro
  • Sterilizzazione (02.09.2012)
  • Pulizia cappa
  • Sterilizzazione vetreria e strumenti
  • Materiale di sterilizzazione vegetale
  • Tecniche di coltura sterile
  • Determinazione del Ph
  • Pericolosità di un prodotto chimico
Procedure di laboratorio di base: 
La maggior parte delle operazioni di laboratorio utilizzate per la propagazione in vitro delle piante può essere facilmente appresa: occorre concentrarsi soprattutto sulla precisione, la pulizia e stretta aderenza ai dettagli quando si eseguono le tecniche in vitro.

Procedure d’accesso 
Deve essere applicata la regola delle "due persone", in base alla quale nessuno nel laboratorio dovrebbe mai lavorare da solo, l’accesso al laboratorio è limitato agli operatori autorizzati che ne conoscono le norme. L’ingresso deve essere mantenuto sempre chiuso, l’entrata e l’uscita si effettuano rigorosamente attraverso il medesimo passaggio definito "zona filtro", gli eventuali ospiti (visitatori occasionali) possono entrare accompagnati da uno dei responsabili e devono attenersi alle procedure di vestizione e generali richieste, gli ospiti devono essere informati del potenziale rischio che le operazioni eseguite nel laboratorio e non possono entrare mentre sono in corso delle operazioni sperimentali, tutte le porte dei laboratori, anche quelle interne, devono essere tenute chiuse durante il lavoro.

Procedure di protezione personale 
Il materiale di vestizione ha lo scopo di provvedere protezione contro contaminazioni da parte di materiale infettivo; tale tipo di vestizione non offre protezione contro potenziale infezione da aereosol. La vestizione avviene nell’anticamera situata subito dopo la prima porta d’accesso. Per l’ingresso al laboratorio è necessario indossare sovracamice con allacciamento posteriore e polsi elasticizzati, copriscarpe, due paia di guanti. Il sovracamice può essere riutilizzato, se non visibilmente contaminato, e dovrebbe essere contrassegnato con il nome dell’operatore. La protezione delle membrane mucose si effettua con l’uso di mascherina e di occhiali di protezione o schermo antischizzi. I capelli devono essere legati e inseriti in un copricapo.Gli indumenti da laboratorio non devono essere indossati al di fuori di esso e vanno decontaminati prima di essere lavati. Dopo la vestizione con camice monouso, sovrascarpe, copricapo e un primo paio di guanti si può superare la porta gialla ed accedere al laboratorio dove è necessario indossare il sovracamice, mascherina e occhiali di protezione, ed un secondo paio di guanti con eventuali coprimaniche. Al termine delle procedure sperimentali e dopo la raccolta del materiale da autoclavare si può procedere a scartare il paio di guanti più esterni ed eventuali coprimaniche all’interno del laboratorio, togliere il copricamice che può essere riutilizzato se non contaminato. I copriscarpe ed il resto del materiale a perdere vanno eliminati all’uscita subito dopo la porta gialla all’interno della zona filtro. Gli operatori sono tenuti ad autoclavare il materiale che è stato usato per la vestizione.

Procedure operative microbiologiche standard 
E’ assolutamente vietato mangiare , bere, fumare, manipolare lenti a contatto e applicare cosmetici nel laboratorio; è proibito pipettare con la bocca: utilizzare solo pipettatrici automatiche; le etichette non devono essere inumidite leccandole; non si devono portare oggetti alla bocca; operare in modo da minimizzare la creazione di aereosol; le superfici di lavoro vanno decontaminate all’inizio ed alla fine del lavoro con etanolo al 70% e immediatamente dopo incidenti di versamento di materiale con ipoclorito di sodio al 5% (candeggina commerciale); le maniglie delle porte vanno decontaminate almeno una volta al giorno con etanolo al 70% utilizzando carta (salviette) a perdere; tutto il materiale contaminato deve essere posto in contenitori chiusi, assicurandosi che non perdano, e autoclavato prima dell’eliminazione; tutte le operazioni sperimentali devono essere condotte all’interno di una cappa di biosicurezza o altra struttura a contenimento fisico. Nessuna operazione con materiale infettivo deve essere condotta su banchi aperti; è proibito l’uso di pipette di vetro e di vetreria con esclusione di vetrini per microscopio (sono preferibili quelli di plastica a perdere) e di strumenti con punte acuminate (siringhe, forbici, bisturi, pipette Pasteur, etc.); il personale deve procedere a lavarsi le mani una volta uscito dal laboratorio dopo la rimozione dei guanti. Non si può procedere all’uscita del laboratorio calzando i guanti. Qualsiasi materiale trasportato fuori dal laboratorio deve essere appropriatamente decontaminato con etanolo e/o ipoclorito e posto in un contenitore pulito, che non richieda l’uso dei guanti, disposto nel passaggio prima dell’ingresso; materiali, strumenti e reagenti e campioni impiegati nel laboratorio possono fuoriuscire solo dopo decontaminazione discussa con il personale responsabile; il laboratorio va tenuto pulito, in ordine e sgombro da qualsiasi oggetto non pertinente al lavoro.


Procedure di ingresso

controllare il manometro per assicurarsi che nel laboratorio esista pressione negativa;
la prima porta deve rimanere aperta il meno possibile;
dopo la vestizione come da punto 1.B (procedure di protezione personale) accedere al laboratorio: le porte dei filtri non possono essere aperte simultaneamente, pertanto controllare la chiusura della porta precedente prima di aprire la successiva;
le porte del laboratorio vanno tenute chiuse durante il lavoro.
All’inizio e al termine delle procedure sperimentali controllare che la cappa sia funzionante;
la cappa va messa in funzione alla mattina mezz’ora prima dell’inizio del lavoro e spenta alla sera mezz’ora dopo l’attività;
pulire la cappa con un disinfettante (etanolo) prima e dopo l’uso: utilizzare ipoclorito per decontaminare;
assicurarsi che la griglia di aspirazione non sia bloccata da materiale;
tenere poco materiale sotto cappa;
il materiale da autoclavare deve essere raccolto nel contenitore per rifiuti speciali;
riporre il materiale da conservare appropriatamente;
eliminare il paio di guanti esterno nel contenitore per rifiuti speciali ospedalieri.

Procedure d’uscita
riporre il camice azzurro, se non contaminato, prima di uscire nel corridoio; tutti gli altri disposable vengono eliminati subito dopo la porta gialla;
attraversare la zona filtro;
riporre il camice o tuta negli armadi, eliminare i copriscarpe ed il secondo paio di guanti;
lavarsi le mani prima di uscire dalla zona filtro.

Procedure per l’ eliminazione del materiale
Gli operatori autorizzati sono responsabili della decontaminazione di tutto il materiale da eliminare. Attenersi scrupolosamente alle seguenti modalità:
tutto il materiale utilizzato durante le procedure sperimentali va autoclavato prima di essere eliminato;
il materiale solido (fiasche, piastre, pipette et.) deve essere trattato con ipoclorito prima di essere raccolto in sacchetti gialli per rifiuti ospedalieri + sacchetti biohazard (all’esterno). Le fiasche vanno chiuse prima dello scarto;
quando il sacchetto biohazard è pieno per i 2/3 del volume è pronto per essere autoclavato; procedere quindi a chiuderlo, non troppo stretto, con il nastro adesivo indicatore;
il materiale liquido va scartato negli appositi contenitori di plastica. Prima di utilizzare il contenitore aggiungere una quantità di ipoclorito di sodio che corrisponda al 20% del volume finale. Quando il volume all’interno del contenitore raggiunge la metà o i due terzi della capacità del contenitore, svuotare in un lavandino del laboratorio. Tutti i liquidi reflui dai lavandini del laboratorio BL3 vengono convogliati in una vasca di decantazione contenente ipoclorito di sodio.



Procedure di decontaminazione

Le soluzioni disinfettanti impiegate devono essere in grado di inattivare specificamente gli agenti patogeni in studio. Per i retrovirus viene usato l’ipoclorito di sodio per decontaminare i versamenti e gli schizzi accidentali e l’alcool al 70% per pulire le superfici di lavoro. Il metodo più semplice ed efficace per inattivare i microorganismi è l’autoclave, ma non sempre è possibile perché alcuni tipi di strumenti sono danneggiati dal calore; in tal caso vanno esaminate le procedure specifiche che utilizzano anche la fumigazione con formaldeide (kit Esoform 70).

Agitatori magnetici, rotanti, vibranti (vortex)
Prima di utilizzare l’apparecchio per mescolare/agitare un campione verificare che:
la velocità di rotazione sia adatta a non provocare schizzi o rotture dei contenitori;
il contenitore del campione sia integro e chiuso ermeticamente (non solo col parafilm);
in caso sia necessario trattenere con le mani il contenitore o il coperchio assicurarsi di garantire una buona presa;
aprire i contenitori sotto cappa attendendo qualche minuto prima di sollevare il coperchio per permettere agli aereosol di depositarsi.

Pulizia e sanificazione degli ambienti
le attività di pulizia e sanificazione dei pavimenti devono avvenire dopo che il personale di laboratorio abbia eliminato eventuali rischi specifici presenti;
accedere all’area protetta solamente indossando dispositivi di protezione individuali - DPI (sovracamice su divisa con pantaloni, guanti sovrascarpe, cuffia);
seguire il percorso attraverso l’area filtro;
effettuare le pulizie dei pavimenti solo ad umido ed almeno 3 volte alla settimana; l’ultimo passaggio deve essere eseguito con panno imbevuto con soluzione di cloro all’1% (ipoclorito commerciale diluito 1:5);
non manipolare alcuna attrezzatura senza l’autorizzazione o la supervisione degli addetti;
in caso di qualsiasi incidente avvertire immediatamente il responsabile del laboratorio ed il proprio responsabile;
non cercare di rimediare autonomamente agli eventuali incidenti che si possono verificare durante il servizio e seguire scrupolosamente le istruzione del personale di laboratorio;
lasciare il laboratorio solo attraverso i percorsi indicati eliminando i DPI negli appositi contenitori prima di uscire dalla zona protetta;
gli attrezzi per la sanificazione usati nell’area protetta non dovranno essere portati fuori di essa e il panno umido usato per le pulizie deve essere autoclavato ed eliminato ogni volta;
deve essere inoltre comunicato al proprio responsabile l’eventuale stato di gravidanza che preclude l’attività nei laboratori a rischio biologico (BL2,BL3), a rischio chimico e uso di radioisotopi.


Pesatura
La preparazione dei mezzi richiede una pesatura accurata di tutti i componenti. Anche se un mezzo è usato in commercio già pronto, la cura deve essere presa nella preparazione delle eventuali soluzioni madri che sono necessarie. A causa della diversità delle bilance da laboratorio in uso, non è possibile rivedere i dettagli del loro funzionamento, quindi le istruzioni del produttore dovrebbero essere consultate prima di usarle. Diverse precauzioni devono essere osservate per ottenere pesi precisi. In primo luogo, la bilancia dovrebbe essere posta su una superficie stabile e solida priva di vibrazioni e correnti d'aria eccessive. L’area di pesata deve  essere sempre tenuta pulita e soprattutto non deve mai essere troppo carica (vedi specifiche del costruttore). 

Misurazione dei liquidi 
Si utilizza la vetreria calibrata (ad esempio, bicchieri, palloni e pipette) necessaria  per la preparazione di terreni di coltura. Cilindri graduati di 10 - 25 - 100 - e con capacità da 1000 ml sono utilizzati per operazioni di misurazione, ma palloni tarati e pipette sono necessari per misure più precise. 

Pulizia vetro 
Il metodo convenzionale di lavaggio della vetreria consiste nel tenere in ammollo il vetro in un bagno di acido cromico acido solforico seguito da risciacqui di acqua di rubinetto, risciacqui acqua distillata, e infine risciacqui di acqua bidistillata. A causa della natura corrosiva di acido cromico, l'uso di questa procedura è stata eliminata. Adeguata pulizia dei vetri più fini può essere realizzata mediante lavaggio in acqua calda (70 ° C) con detergenti commerciali, risciacquo con acqua calda (70 ° C ), e infine risciacquo con acqua distillata e bidistillata. Tuttavia, vetro altamente contaminati devono essere puliti in un bagno di acido cromico acido solforico o ad altri metodi. La seguente procedura generale è raccomandata per la pulizia di oggetti di vetro che contiengono i mezzi di culture dopo che tutti gli espianti sono stati raccolti:

1.     Autoclavare tutta la vetreria con i mezzi e le culture ancora in esso. Questo uccide tutti i microrganismi contaminanti che potrebbero essere presenti. 

2.     Dopo che i mezzi in autoclave si sono raffreddati, ma mentre è ancora allo stato liquido, versatelo in sacchetti di plastica bio-hazard o spessi sacchetti di plastica

3.     Lavare tutta la vetreria con acqua e sapone utilizzando uno spazzolino adatto per bottiglie per pulire le parti interne del vetro. Tutta la vetreria macchiata dovrebbe essere messa in un bagno di acido solforico concentrato dicromato di potassio, acido per 4 ore, poi sciacquati dieci volte prima di lavare con acqua e sapone. 

4.     Tutti gli strumenti di vetro devono essere risciacquati tre volte in acqua di rubinetto, per tre volte in acqua deionizzata, tre volte in acqua bidistillata, essiccati e conservati in un luogo pulito. 

5.     Lavare tutti gli strumenti e bicchieri nuovi in un modo simile.


 Sterilizzazione (02.09.2012)
Le parte più noiosa della tecnica di colture in vitro sono le sterilizzazioni di materiali vegetali e mezzi di colture e il mantenimento di condizioni asettiche, una volta che sono stati raggiunti. Batteri e funghi sono i due agenti inquinanti più comuni osservati in colture cellulari: le spore fungine sono leggere e presenti in tutto il nostro ambiente. Quando una spora fungina viene a contatto con i terreni di coltura utilizzati nella coltura del tessuto, le condizioni sono ottimali per la germinazione delle spore e la conseguente contaminazione della cultura.   Per la sterilizzazione camere di cultura e cappe di trasferimento  di grandi dimensioni sono sono utilizzati i raggi ultravioletti (UV). Il tempo di sterilizzazione varia a seconda della grandezza della stanza e deve essere fatto solo quando non ci sono sperimentazioni in corso. La radiazione ultravioletta è dannosa per gli occhi: stanze più piccole o cappe di trasferimento di scarse dimensioni possono essere sterilizzati con raggi UV o trattamento con battericidi e / o fungicidi. Le  cappe a flusso laminare sono facilmente sterilizzabili  pulendo tutte le superfici con il 95% di alcol etilico  15 minuti prima di iniziare qualsiasi operazione.  Le camere di cultura dovrebbe essere inizialmente pulita con un sapone detergente e poi accuratamente puliti con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2% o 95% di alcol etilico. Tutti i pavimenti e le pareti devono essere lavati delicatamente su una base settimanale con una soluzione simile; estrema cautela deve essere utilizzata per evitare il fomentare di qualsiasi contaminazione che si è stabilito.


La sterilità è un requisito essenziale per la coltivazione di cellule vegetali in vitro, dal momento che i terreni nutritivi ottimali per le cellule vegetali permettono anche la crescita di diversi microorganismi. I tessuti interni della pianta sono generalmente sterili, mentre la superficie è ricoperta da vari tipi di microorganismi. La rimozione di questi ultimi è pertanto indispensabile se si vuole evitare la contaminazione dell’espianto al momento dell’inizio della coltura in vitro.  Ciò si ottiene mediante semplici metodi di sterilizzazione superficiale. Un metodo frequentemente usato è quello di immergere il vegetale intero o l’organo vegetale dapprima in alcool al 70-95% per pochi minuti quindi, per pochi minuti, in una soluzione contenente il 2% di ipoclorito di sodio. Qualche goccia di un detergente aggiunta alla soluzione di ipoclorito, scioglie i lipidi spesso presenti sulla superficie  del vegetale  permettendo così alla soluzione sterilizzante di penetrare più profondamente. La soluzione quindi verrà rimossa tramite numerosi lavaggi con acqua sterile. Il procedimento di sterilizzazione può danneggiare le cellule esterne ma non quelle più interne che sono quindi disponibili per l’inizio della coltura sterile.



Pulizia cappa 
  • Prodotto decontaminante da utilizzare: Aldek ( tensioattivi ionici-non ionici, alchildimetilbenzilammonio )
  • Prodotto disinfettante da utilizzare in alternativa: Colloidale Gamma ( polifenolico, tensioattivi )
  • Richiesta del decontaminante e del disinfettante: in Farmacia sui prodotti galenici
  • Dispositivi da utilizzare per la sicurezza: camici monouso, occhiali di protezione, mascherine, guanti in lattice .
1. Prima di utilizzare le cappe
Durante tale operazione la cappa è aperta, la luce è accesa ed è azionato il flusso laminare.
· Indossare il camice monouso, la mascherina, gli occhiali di protezione ed i guanti.
· Pulire a fondo la cappa secondo la procedura che prevede l’utilizzo di panno carta con il decontaminante “Aldek”, spruzzando abbondantemente e diffusamente il piano di lavoro. Dopo 30’’ asciugare con panno asciutto.
· Attendere che il flusso laminare si sia stabilizzato ( almeno 15 minuti) ed operare.

2. A fine lavoro
Durante tale operazione il flusso laminare della cappa continua ad essere funzionante. Continuare ad indossare i dispositivi di protezione camice monouso, la mascherina, gli occhiali di protezione ed i guanti che vanno cambiati.
· Asportare dal piano della cappa tutti i dispositivi, accessori utilizzati durante il lavoro.
· Pulire a fondo la cappa secondo la procedura che prevede l’utilizzo di panno carta con il decontaminante “Aldek”, spruzzando abbondantemente e diffusamente il piano di lavoro, le pareti laterali e il vetro. Dopo 30’’ asciugare con panno asciutto e non risciacquare.
· Attendere almeno 10 minuti prima di spegnere il flusso laminare, chiudere la cappa e ( se presenti ) accendere le luci ultraviolette per almeno 30 minuti.

3. Una volta alla settimana
Una volta alla settimana o su segnalazione del personale pulire a fondo la cappa secondo la procedura che prevede l’utilizzo di panno carta per i lavaggi , la disinfezione e l’asciugatura. Si consiglia di predisporre una griglia con l’indicazione del giorno della settimana nel quale eseguire la procedura e lo spazio per la firma dell’operatore che la esegue. Durante tale operazione la cappa è aperta, la luce è accesa ed è azionato il flusso laminare.
· Indossare il camice monouso, la mascherina, gli occhiali di protezione ed i guanti.
· Togliere i pannelli asportabili e lavarli bene con acqua e sapone. Risciacquare e passare un panno carta per asciugare.
· Lavare bene con acqua e sapone le pareti laterali, il vetro e il piano di raccolta della cappa. Risciacquare e passare un panno carta per asciugare.
· Quindi spruzzare abbondantemente la soluzione decontaminante “Aldek”. Dopo 30’’ passare un panno carta per asciugare e non risciacquare.
· Rimettere i pannelli precedentemente rimossi.
· Firmare l'apposito modulo .
· Attendere almeno 10 minuti prima di spegnere il flusso laminare, chiudere la cappa e ( se presenti )  accendere le luci ultraviolette per almeno 30 minuti.

4. Una volta al mese
Compatibilmente con le operazioni che si fanno sotto cappa, nella procedura di pulizia settimanale, sostituire il decontaminante “Aldek” con il disinfettante polifenolico “Colloidale Gamma” diluito allo 0,5% in acqua. Il decontaminante Aldek può essere usato anche per attrezzature quali incubatori, centrifughe.

Sterilizzazione vetreria e strumenti 
Strumenti di metallo sono meglio sterilizzati utilizzando una sterilizzatrice a perline di vetro. Queste lavorano a temperature di circa 275-350 ° C e distruggono le spore batteriche e fungine presenti sugli strumenti. Gli strumenti vengono semplicemente inseriti nelle perle di vetro riscaldato per un periodo di 10 - 60 sec. Gli strumenti dovrebbero essere posti su una rastrelliera per raffreddarli fino al momento dell'uso. Gli strumenti di metallo, vetro, alluminio, ecc, possono anche essere sterilizzati con esposizione ad aria calda secca (130 ° -170 ° C) per 2-4 ore in un forno ad aria calda. Tutti gli articoli devono essere sigillati prima della sterilizzazione, ma non con carta, in quanto si decompone a 170 ° C. L’autoclave non è consigliabile per gli strumenti in metallo, perché potrebbe formarsi della ruggine. Strumenti che sono stati sterilizzati in aria secca calda devono essere rimossi dal loro involucro, immersi nel 95% di alcol etilico, ed esposti al calore di una fiamma. Dopo che uno strumento è stato utilizzato, può essere nuovamente imbevuto di alcol etilico, reflamed, e quindi riutilizzati. Questa tecnica è chiamata sterilizzazione alla fiamma. La sicurezza è una preoccupazione importante quando si usa l'alcool etilico. L'alcool è infiammabile e se versato nei pressi di una fiamma causerà un incendio flash istantaneo. Questo problema è aggravato in cappe a flusso laminare a causa delle forti correnti d'aria soffiata verso il lavoratore. L’autoclave è un metodo di sterilizzazione con vapore acqueo sotto pressione per: tappi di cotone, garze da laboratorio, tappi di plastica, vetro, filtri, pipette, acqua, nutrienti e dei mezzi che possono essere sterilizzati in autoclave. Quasi tutti i microbi vengono uccisi dall’ esposizione al vapore surriscaldata di una autoclave per 10-15 minuti. Tutti gli oggetti devono essere sterilizzati a 121 ° C e 15 psi per 15-20 min. 




Sterilizzazione terreni di coltura 
Due metodi (filtrazione e trattamento in autoclave a membrana a pressione positiva) sono comunemente usati per sterilizzare terreni di coltura. Terreni di coltura, acqua distillata, e di altri miscugli stabili possono essere autoclavati in recipienti di vetro che sono sigillati con tappi di cotone, fogli di alluminio, o chiusure di plastica. Tuttavia, le soluzioni che contengono componenti termicamente labili devono essere sterilizzati per filtrazione. In generale, i mezzi  nutrienti sono sterilizzati in autoclave a 15 psi e temperatura di 121 ° C. Per i piccoli volumi di liquidi (100 ml o meno), il tempo necessario per la sterilizzazione è di 15-20 min, ma per grosse quantità (2-4 litri), è necessaria 30-40 min. La pressione non deve superare i 20 psi, perchè pressioni elevate possono portare alla decomposizione dei carboidrati e di altri componenti termolabili di un mezzo. Dal momento che molte proteine, vitamine, aminoacidi, estratti di piante, ormoni, e carboidrati sono termolabili e possono decomporsi in autoclave, la sterilizzazione tramite filtraggio può essere richiesta.  Substrati nutritivi che contengono componenti termolabili possono essere preparati in diversi passaggi. Cioè, una soluzione dei componenti termostabile è sterilizzata nel modo consueto in autoclave, raffreddata a 50 ° - 60 ° C in condizioni sterili. Le soluzioni sterilizzate sono poi combinate in condizioni asettiche per dare il supporto completo. 

Materiale di sterilizzazione vegetale
Ottenere il materiale sterile da una pianta è difficile, e nonostante le precauzioni prese, il 95% delle culture finirà contaminata se l'espianto non è disinfettato in qualche modo. Quanto i materiali vivi  non possono essere esposti a calore estremo e mantengono la loro capacità biologiche, organi e tessuti vegetali vengono sterilizzati con un trattamento con una soluzione disinfettante. Le soluzioni utilizzate per sterilizzare espianti devono mantenere il tessuto vegetale, ma allo stesso tempo distruggere eventuali contaminanti fungine o batteriche. Una volta che gli espianti sono stati ottenuti, questi devono essere lavati con un detergente sapone neutro prima del trattamento con una soluzione sterilizzante. Alcuni materiali di piante erbacee (ad esempio, foglie di violetta africana) non possono richiedere questo passaggio, ma il materiale legnoso, tuberi, ecc, devono essere accuratamente lavati. Dopo che il tessuto è stato lavato, va sciacquato sotto acqua corrente per 10-30 minuti e poi essere immersa nel disinfettante in condizioni sterili. Tutte le superfici dell’ espianto devomo essere a contatto con lo sterilizzante. Dopo il tempo assegnato per la sterilizzazione, l’agente sterilizzante deve essere travasato e gli espianti lavati almeno tre volte in acqua distillata sterile. Per i materiali che sono difficili da disinfettare, può essere necessario ripetere il trattamento 24-48 ore prima di effettuare gli espianti finale. . 

Tecniche  Coltura Sterile
Il successo del controllo della contaminazione  dipende in gran parte delle tecniche di guida nella cultura asettica. Si dovrebbe sempre essere consapevoli delle potenziali fonti di contaminazione quali polvere, capelli, mani e vestiti. Ovviamente, le mani devono essere lavate, maniche rimboccate, i capelli lunghi legati sulla nuca, ecc. Lavarsi le mani con il 95% di alcol etilico è una misura semplice che può essere presa. Parlare o starnuti mentre la materia è esposta può portare alla contaminazione. Quando parti di pianta si trasferiscomo da un contenitore all'altro, non toccare i bordi interni. Osservando il modo con  cui si verifica una contaminazione di una cultura, si può essere in grado di determinare la fonte di contaminazione.  Nella cultura tessuto vegetale, piccoli pezzi di tessuto vegetale sono posti su o in un mezzo ricco di sostanze nutritive e zucchero. Se i batteri o funghi entrano in contatto con il tessuto della pianta o del mezzo, la cultura diventa contaminata. I contaminanti (batteri e funghi) utilizzeranno sostanze nutritive dal terreno e la pianta, che distrugge rapidamente il tessuto vegetale. Il nostro obiettivo è quello di sterilizzare la superficie del tessuto vegetale e ottenere un terreno di coltura sterile, senza batteri o funghi. Questo non è facile perché i batteri e spore fungine sono in aria, su di noi, in noi, e sotto di noi!  Quando si vede la luce solare che brilla in una finestra è possibile, da certe angolazioni, vedere le particelle di polvere nell'aria. Ci sono centinaia di batteri legati ad ogni particella di polvere. Una unità di cappa a flusso laminare orizzontale è progettats per rimuovere le particelle dall'aria. L’aria nella cappa è aspirata dala parte superiore dell'unità e spinta attraverso un filtro HEPA (High Energy Particle Air), ventola con una velocità uniforme di 90 m / min attraverso la superficie di lavoro. L'aria viene filtrata dal filtro HEPA di 0,3 um (micrometri) e vi può passare attraverso. Questo rende l'aria sterile. Il flusso di aria dalle unità scoraggia qualsiasi spora di batteri a penetrare. Tutti gli articoli in all'interno devono essere sterili o irrorati con etanolo o alcool isopropilico. Essi rimarranno sterili se non contaminarti. Una scatola di cartone rivestita con un foglio di alluminio o di plastica, o un acquario ben pulito, offre una protezione per ridurre la contaminazione. Una scatola che è 20-24 centimetri di larghezza, 20-24 cm di altezza, e 12-16 pollici offre una buona zona profonda del lavoro. Lavorare all'interno di una qualsiasi di queste non garantisce il successo. Le seguenti precauzioni sono necessarie per tutte le aree di lavoro. 
1. La stanza dovrebbe essere spazzata e, se possibile, asciutta. 
2. Ogni piano di lavoro deve essere lavato con un CloroxR 10%, LysolR, o altra soluzione disinfettante.  
3. Porte e finestre devono essere chiuse.  
4. Condizionatori e ventilatori devono essere spenti. 
5. Se possibile, ogni studente deve avere uno spazio di lavoro che può essere opportunamente trattato contro la contaminazione. Ad esempio, la scatola o acquario detto in precedenza, o un pezzo di carta posto sul tavolo per indicare un'area di lavoro sterile dello studente. 
6. Riempire le bottiglie spray con il 70% di etanolo o isopropanolo (mai metanolo) posti in modo che ogni studente ha accesso ad una bottiglia. Spray tutto ciò che accade nella zona sterile. 
7. Avere una zona centrale di alimentazione in modo tutti gli oggetti necessari possono essere raccolti e portati al lavoro, se necessario. Gli oggetti possono essere restituiti alla zona centrale di alimentazione dopo l'uso. 
8. Strumenti sterili per ogni persona. Un modo per farlo è quello di avere un vaso di ½ litro di etanolo al 70% per bisturi e pinze a breve. Quando il tessuto deve essere posizionata in un vaso, pinza lunga 10 pollici sono necessari. Le pinze lunghe devono essere poste abbastanza profondo in alcool. Un cilindro graduato da 100 ml può essere utilizzato per contenere l'alcol e la pinza lunga. Un vaso ½ litro di acqua sterile è necessaria per tuffare gli strumenti per rimuovere i residui di alcool che potrebbe asciugare tessuti vegetali. 
9. Una superficie di lavoro sterile è necessaria per posizionare il tessuto sterile per tagliare esso. La cosa più facile da usare è una piastra di Petri sterile. Se si dispone di quelle in vetro, è possibile autoclave e riutilizzarli. Piatti presterilizzati di plastica vengono utilizzati e scartati. Spruzzare il sacco di piatti con il 70% di alcool prima di aprirlo e inserire il numero desiderato di piatti non aperti ad ogni stazione.  
10. I capelli lunghi dovrebbero essere legati indietro o coperte. Lavare le mani  e spruzzatle con il 70% etilico o alcool isopropilico o stratificate con gel di alcool isopropilico. Guanti e maschere possono fornire una protezione extra. Non parlare durante l'esecuzione di operazioni di sterile. Non appoggiatevi sopra il vostro lavoro. Tenere la schiena contro lo schienale della sedia.  Non passare oggetti non sterili su aree sterili o articoli.  Fai movimenti dolci e aggraziati in modo da non disturbare l'aria più del necessario. Lavora velocemente, però, il tempo che impiegi per manipolare i tessuti può aumentare le possibilità di contaminazione. Rimuovi elementi che non sono più necessari il più rapidamente possibile. Le colture possono essere conservate in una zona ben illuminata (non in luce diretta del sole), e non consentono di superare la temperatura di 800 F. Se si è messa culture sotto le luci, usare solo la luce fluorescente. L'orario preferito è di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Controllare la temperatura prima di mettere le culture sotto le luci. Controllare le colture ogni 3-5 giorni per la contaminazione. Non aprire i contenitori che sono contaminati. I contaminanti potrebbero essere patogeni. L'unico modo sicuro per smaltire questi è quello di autoclave (o pressione-cuoco), li per 15 minuti a 15 psi.


La determinazione del pH 
Il pH di una soluzione è una misura della concentrazione di ioni idrogeno nella soluzione. La scala del pH si estende da molto acido (0) a molto alcalina (14) con 7 è il punto "neutrale. Il pH della maggior parte dei mezzi cultura è regolata a 5.7 ± 0.1 prima della sterilizzazione in autoclave. Il pH può influenzare la solubilità di ioni in terreni di coltura, la capacità di agar di gel, e la successiva crescita delle cellule.  In generale, il pH è determinato con un pH-metro.



Come capire il grado di pericolosità di un prodotto chimico?
Per assicurare un impiego in sicurezza, tutti i reagenti ed i prodotti chimici potenzialmente pericolosi sono corredati da un’etichetta conforme alla direttiva CEE 67/548. Sull’etichetta potrai trovare, oltre al nome del prodotto, il tipo di pericolosità con il suo simbolo, la natura dei rischi (indicati dalla lettera R seguita da uno o più numeri) e le norme di prevenzione (indicate con la lettera S seguita da uno o più numeri). Anche le soluzioni preparate dal tuo insegnante saranno contrassegnate da un’etichetta con l’indicazione del tipo di pericolo e delle precauzioni da usare. Di seguito puoi vedere come si presenta l’etichetta di uno dei reattivi in dotazione al nostro laboratorio




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