Micropropagazione della patata 2

Prelevare talee nodali ed interi ger­mogli da colture in vitro stabilizzate provenienti a loro volta dalla sterilizzazione e messa in coltura del materiale di propagazione di partenza (tuberi ger­mogliati). La mag­gior parte delle cultivar (genotipi) di patata possono essere indotte a formare tuberi in vitro; tuttavia, la capacita di dare origine a microtuberi e influenzata dal genotipo. Cultivar quali "Kennebec", "Superior", "Red Pontiac" o "Russet Burbank" sono dotate di tale capacita. (Leclerc et al., 1994). Si raccomanda l'uso di tuberi di patata freschi che non presentino segni di deperimento.

Successivamente lavare i tuberi sotto acqua corrente e quindi immer­gerli in una soluzione di candeggina commerciale al 20% (v/v) (1,05% NaOCl) per 10 minuti. Tagliare i tuberi in cinque o dieci pezzi di 2 cm² circa e quin­di immergerli per un'ora in una soluzione di acido gibberellico (100 mg/1) per interrompere la dor­mienza e favorire il germogliamento. Porre le sezio­ni in vermiculite umida all'interno di una camera climatica a circa 25 °C con un fotoperiodo di 16 ore di luce fluorescente. Prelevare i germogli quando hanno raggiunto approssimativa­mente la lunghezza di 3-5 cm.

Per iniziare la coltu­ra dovrebbero essere usati apici delle dimensioni di 5-10 mm. Sciacquare gli apici sotto acqua corrente per 10 minuti e quindi sottoporli a sterilizzazione in una soluzione di candeggina commerciale al 20% agitando costantemente per 10 minuti. Quindi sciacquare tre volte per 5 minuti in acqua distillata sterile. Eliminare la parte di tessuto danneggiato dalla candeggina e collocare ciascun apice in un tubo di coltura (150 x 25 mm) contenente 15 ml di un mezzo costituito dai sali di base di Murashige e Skoog, 87,6 mM (30 g/L) di saccarosio, 0,56 mM (100 mg/L) di mioinositolo e 1,2 pM (0,4 mg/L) di tiami­na-HCI, e solidificato con 8 g/L di agar. Questo mezzo puO essere acquistato preconfezionato, senza saccarosio ed agar, da Sigma Chemical, St. Louis, MO (M-6899).

Dopo 30-40 giorni di coltura i germogli dovrebbero avere la lunghezza di 4-6 cm. Le talee nodali prelevate da tali colture sono sottoposte a subcoltura nello stesso mezzo, ad intervalli di 4-6 settimane.

Mezzo di coltura

Da oggi potrete trovare una nuova dispensa sul blog dedicato alla micropropagazione. la nuova pagina di approfondimento riguarderà una componente importantissima del processo micropropagativo: la composizione del mezzo di coltura. Indispensabile per un'ottima realizzazione dei nostri espianti. Nella pagina mezzodi coltura troverete interessanti nozioni sui componenti del subtrato, tabelle con i mezzi di coltura più famosi e un interessante capitolo sui fitoregolatori più utilizzati. Nei prossimi giorni questa dispensa sarà integrata anche con un altro capitolo in lavorazione inerente alle condizioni della camera di crescita. Buona lettura.

Micropropagazione della patata

In questi giorni oltre a preparare la tesi (dovrebbe essere rilegata per mercoledì prossimo) mi sono dedicato alla semina di alcune varietà extra-piccanti di peperoncini Habanero e Tabasco per rilassarmi in vista del 23 maggio. Oltre a questo ho avuto modo di riorganizzare il lavoro del blog e ho deciso di ripartire da dove eravamo rimasti: dalla micropropagazione della patata. Con questo articolo inizierà il percorso per riuscire a micropropagare le nostre prime piantine di patata in casa.

La patata (Solanum tuberosum L.), coltura d'impor­tanza mondiale, rappresenta un alimento essenziale nella dieta di una larga parte della popolazione del mondo. La produzione della patata è al quarto posto tra le maggiori colture alimentari. A differenza di altre colture di uso alimentare essa e propagata vege­tativamente e purtroppo, a causa di questo metodo di propagazione, risulta suscettibile a molte infezio­ni di origine virale, fungina e batterica. Sono cono­sciuti almeno 23 virus in grado di infettare la patata riducendone la qualità e la produttività. La propaga­zione della patata mediante materiale vegetale prove­niente da tuberi da consumo, causa la diffusione e la moltiplicazione di tuberi infetti. La produzione di tuberi seme privi di patogeni è una pratica ormai di routine che permette di mantenere un'adeguata pro­duttività (Miller e Lipschultz, 1984). Questo obietti­vo è raggiunto mediante la coltura di apici meriste­matici per l'ottenimento di tuberi seme denominati SPT (specific pathogen freetested), in cui cioè è stata verificata l'assenza di patogeni specifici (Cassels e Long, 1982). La micropropagazione è successiva­mente applicata per propagare clonalmente le plan­tule provenienti da coltura meristematica. Due tecniche di micropropagazione, molto sem­plici ma affidabili, possono essere applicate alla pata­ta. La prima tecnica, denominata coltura di nodi sin­goli o multipli, implica la produzione di germogli mediante coltivazione di nodi singoli o multipli (propaggine in vitro) posti orizzontalmente nel mezzo di coltura. Nella patata i segmenti nodali sono prelevati da colture di germogli STP provenienti a loro volta da apici meristematici allevati in vitro. E’ da puntualizzare che la patata non pub essere moltiplicata mediante il metodo della coltura di germogli (propa­gazione in vitro mediante successivi cicli di prolifera­zione di gemme ascellari). Infatti, nel caso specifico l'aggiunta di citochinine non induce proliferazione di gemme ascellari. Normalmente nella patata è pos­sibile, invece, ottenere rapidamente germogli privi di ramificazioni, allungati e composti di nodi multipli. Questi germogli (microtalee) o sono radicati ed accli­matati alle condizioni di pieno campo o sono suddi­visi in talee uninodali per iniziare nuove colture in vitro. Sebbene non sia il metodo più effi­ciente di micropropagazione, la coltura di nodi è il procedimento più affidabile per produrre in vitro piante dalle caratteristiche rispondenti alla pianta madre (true to type).La seconda e forse più affascinante tecnica di micro­propagazione implica la produzione di tuberi minia­turizzati (microtuberi) da germogli di patata allevati in vitro. Tale tecnica, oltre che essere un utile metodo di propagazione e conservazione di ger­moplasma dotato di caratteristiche di pregio, può essere adattata ai metodi commerciali di propagazio­ne automatizzata e agli impianti di meccanizzazione di pieno campo su larga scala (McCown e Joice, 1991). A seconda delle cultivar, lo sviluppo di microtuberi è favorito da condizioni di fotoperiodo corto e dall'aggiunta nel mezzo di coltura di una citochinina e di elevate dosi di saccarosio (Seabrook et al., 1993; Gopal et al., 1998).Se l'impianto e le successive fasi di sviluppo dei mi­crotuberi avvengono in condizioni ideali, la coltura ha un comportamento uguale a quella da tuberi seme (McCown e Wattimena, 1987).

Effetti della qualità della luce nella micropropagazione

Come promesso sono tornato! Questa mattina ho finalmente completato la tesi del corso di Laurea in Scienze Agrarie dal titolo "Effetti della qualità della luce nella micropropagazione". Un lavoro lungo ma appassionante che ha coronato un intenso percorso di studi. Come avrete notato sono stato a lungo lontano dalle pagine del blog, ma da oggi tornerò quotidianamente a scrivere ed aggiornare queste pagine. Dopo il giorno della Laurea, inizierò a pubblicare alcuni interessanti capitoli del mio elaborato. Per il momento pubblico il frontespizio della  mia tesi, per festeggiare il completamento dell'elaborato. A domani!

Assenza giustificata

Ciao a tutti. Lo so è un po' che non mi faccio vivo ma vi assicurò che non potevo fare diversamente. Sto ultimando la tesi, proprio sulla micropropagazione in vitro, e l'impegno in politica mi porta via un sacco di tempo e di energie, e tutto questo si ripercuote sul tempo da dedicare al blog. Ho voluto scrivere queste poche righe per ringraziare i molti amici che continuano a visitare il blog nonostante la mia latitanza. Appena la tesi sarà terminata (manca poco) metterò sul blog alcuni paragrafi che molti di voi troveranno sicuramente interessanti, visto il particolare settore che ho cercato di affrontare. Abbiate ancora un po' di pazienza e a presto!

Protocollo Vitis Vinifera

Vite (Vitis vinifera L.) è una delle colture da frutto più coltivato nel mondo. Il classico miglioramento genetico delle cultivar, al fine di ottenere vini di alta qualità e  varietà di uva da tavola, con i metodi convenzionali di ibridazione, non sembra essere  un approccio pratico; pertanto sono stati proposti metodi non convenzionali. Un  prerequisito per sviluppare tali approcci per la vite, è la capacità di effettuare efficaci tecniche di rigenerazione "in  vitro. La micropropagazione rappresenta un efficiente metodo di rigenerazione delle piante e permette una rapida propagazione  attraverso l'organogenesi ed embriogenesi .  Ecco quindi di seguito un interessante protocollo per micropropagare la Vite adottato in Romania e testato dall'Universita di Bucarest.

Materiali e metodi  Piante: tagli ottenuti da vitigni con 10-15 anni di età,  appartenenti alle cultivar di uva "Soltanin" e "Sahebi" , poste in serra per registrare un allungamento di 10 cm  e i germogli sono stati utilizzati come fonti di espianto. I segmenti di germogli con gemme apicali e ascellari vengono  disinfettati per 15 minuti, agitando continuamente in candeggina al 5%, dopo di che le gemme  sono state sezionate per rimuovere tutte le foglie estranee ad eccezione del picciolo.

Morfogenetica e stabilizzazione: i germogli sono stati trasferiti al mezzo culturale di iniziazione, composto da:  

• ·         30 g/L saccarosio,
• ·          6 g/L agar,
• ·         con quattro tipi di ormoni:

o   1mg/LBA (6-benzilaminopurina)],

o   1.5 mg/L BA,

o   1 m/gL IBA (acido indolo-3-butirrico)

o   1 mg/L TDZ (thidiazuron]

Dopo 3/4 settimane, per una migliore proliferazione, le colture sono state trasferite in terreni di coltura freschi per un ulteriore  allungamento dei germogli. Dopo di che si trasferiscono i germogli su di un substrato MS integrato con 1mg/L TDZ + 1.5mg/L GA3  (Acido gibberellico). Infine, i germogli sono stati tolti e trasferiti ai media radicamento. 

Fase radicazione: I germogli ottenuti dai terreni di coltura sono stati testati per la capacità radicazione. Per sradicare "in vitro" i germogli sono stati coltivati in terreno MS integrato con 0.5mg/L NAA (α - acido naftalene acetico).  Dopo di che le piantine sviluppatisi in vitro sono state acclimatate in ambiente controllato, in particolari condizioni di elevata umidità relativa. Infine le piantine sono state asportate e pretrattate con 1mg/L IBA, e poste direttamente  in vaso coperti con un telo di plastica per simulare l’effetto serra all'interno e con effetto di nebulizzazione per 4 settimane. In seguito, le piantine radicate sono state  trasferite in serra senza coperchio di plastica e senza sistema di nebulizzazione. 

Micropropagazione Vitis Vinifera 2

L’efficacia della sterilizzazione ha limitato notevolmente la fase di allestimento delle colture, infatti è apparsa fortemente dipendente dalla varietà, dal periodo del prelievo degli espianti in campo, dalla grandezza della gemma iniziale e dallo stato fitosanitario del materiale di partenza. Inoltre la percentuale di espianti inquinati è stata condizionata in maniera evidente dal lasso di tempo intercorso tra il prelievo in campo e la sterilizzazione (Tab 3A).

Dall’esperienza si deduce che il protocollo ideale richiederebbe che le gemme fossero sterilizzate e allestite nella stessa giornata del prelievo o al massimo entro 2-3 giorni. Inoltre, solo l’impiego della doppia sterilizzazione (NaOCl per 20’ seguito dal Na mertiolato per altri 20’) ha permesso di ottenere risultati soddisfacenti (Tab 3B). Il 79% delle gemme sterili ha iniziato a rigonfiarsi e ad allungare le prime foglioline.

Sono state osservate differenze nella risposta all’allestimento delle colture axeniche tra le cultivar, infatti mentre alcune di esse non hanno manifestato stress fisiologici particolari (Cesanese d’Affile, Procanico e Trebbiano Verde), nelle altre sono stati spesso osservati fenomeni di iperidricità o di ossidazione (Aleatico, Bellone e Ottonese).

Il terreno utilizzato per l’allestimento (Tab. 2 terreno b), si è dimostrato molto funzionale nelle prime due subculture (20-40 giorni), infatti non si sono mai verificati fenomeni di formazione di callo, cosa che invece avveniva lasciando le piantine su questo terreno per periodi più lunghi. Questo è in accordo con quanto sostenuto da molti vivaisti, che si sono dimostrati prudenti verso le piante micropropagate a causa delle possibili mutazioni imputabili principalmente all’impiego delle citochinine nel substrato di coltura. Dalle numerose prove sperimentali effettuate è emerso che effettivamente l’uso delle citochinine nel terreno favorisce la formazione di tessuto indifferenziato (callo) che è il precursore della formazione di germogli avventizi. Per evitare questo problema è stato studiato un nuovo sistema di propagazione in vitro nel quale non sono state utilizzate le citochinine, ma solo l’IBA (Tab. 2 terreno d), auxina normalmente impiegata anche nel taleaggio in vivo. Il sistema di moltiplicazione sperimentato, quindi, è stato quello del microtaleaggio (Fig. 2) che consiste nel fare semplicemente allungare la piantina e suddividerla poi in 3 o 4 parti. Inoltre questa tecnica permette di ottenere piantine già radicate con un conseguente risparmio economico e di tempo. Quindi ad una prima fase, molto rapida (30 giorni) di allestimento del materiale vegetale sul terreno con citochinine (Tab 2 terreno b) è seguita poi la vera e propria propagazione su terreno contenete solo auxina (Tab 2 terreno d) come fitormone. Questo ha permesso di allestire con successo le gemme, dal momento che i substrati contenenti IBA, da prove effettuate, risultano inefficaci nei primi stadi dell’accrescimento, indebolendo i germogli fino alla morte degli stessi.